核糖核酸扩增荧光定量

原标题:新冠前沿科学,核酸检测,什么是荧光定量PCR?

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  新冠前沿科普

  当前上海正处于抗新型冠状病毒肺炎疫情防控的关键阶段,在这个没有硝烟的战场上,及时快速地筛查新冠感染者并及时进行隔离是阻止新冠病毒肆意蔓延的最有效且唯一的手段。核酸检测是目前筛查新冠感染者最精准、有效、低成本的技术方式。

  新冠病毒和核酸的关系?

  核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称,是所有生物中最重要的遗传物质。他们相当于生物的“图纸”,细胞相当于“工厂”,通过各种各样的“图纸”可以创造出各种各样的细胞,从而组成生物,所以说核酸是一个创造生物的神奇东西。

  新冠病毒的核酸是核糖核酸(RNA),而且是单链,不稳定,容易产生变异。新冠病毒就像是强盗,手里拿着“图纸”,但是没有“工厂”。于是,新冠病毒便侵入人体细胞,抢夺“工厂”的控制权,利用抢夺来的“工厂”继续生产自己的新冠病毒大军,危害人们的健康。

  什么是核酸检测?

  核酸检测就是通过判断人们体内容易被病毒侵入地方(鼻腔或喉咙扁桃体等)的分泌物中是否含有新冠病毒生产出来的“大军”,从而判断是否感染了新冠病毒

核糖核酸扩增荧光定量

核糖核酸扩增荧光定量(网络配图 侵删)

  核酸检测

核糖核酸扩增荧光定量

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核糖核酸扩增荧光定量

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  新冠病毒核酸检测主要用荧光定量RT-PCR技术,这种技术是荧光定量PCR技术与RT-PCR技术的结合。在检测过程中,先采用RT-PCR技术将新冠病毒的核酸(RNA)逆转录为对应的脱氧核糖核酸(DNA);再采用荧光定量PCR技术,将得到的DNA进行大量复制,同时,使用特异性探针对复制得到的DNA进行检测,打上标记。如果存在新冠病毒核酸,仪器就可以检测到荧光信号,且随着DNA的不断复制,荧光信号不断增强,这样就间接检测到了新冠病毒的存在。

  什么是PCR?

  聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),简称PCR,又称多聚酶链式反应,是一项利用DNA双链复制的原理,在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。透过这项技术,可在短时间内大量扩增目的基因,而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。

核糖核酸扩增荧光定量

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  PCR扩增的三个基本步骤

核糖核酸扩增荧光定量

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  (1)变性:模板DNA经加热至94℃左右并保持一定时间后,基于DNA半保留复制原理,还有碱基互补配对原则,即复制的过程中双链DNA会解链,由双链变成单链,为下轮反应做准备;

  (2)退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

  (3)延伸:温度再升至72℃左右,在DNA聚合酶的作用下,把游离的dNTP按照碱基互补配对原则结合到单链上,形成一条由旧链和新链杂合成的新的双链DNA。

核糖核酸扩增荧光定量

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  PCR扩增原理:变形-退火-延伸温度循环

  理论上,经过上面步骤,目标DNA浓度可增加一倍。重复循环上述过程,可获得更多的“半保留复制链”,而形成的新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,仅需2~3小时就能将目标DNA扩增放大几百万倍。

核糖核酸扩增荧光定量

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  全自动核酸提纯及实时荧光PCR分析系统

  经过以上分析,我们就可以理解为什么核酸检测结果最快能在几个小时内出结果。

核糖核酸扩增荧光定量

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  实时荧光PCR定量分析    

核糖核酸扩增荧光定量

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  PCR扩增仪温度控制指标

核糖核酸扩增荧光定量

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  PCR扩增仪温度控制指标主要有:温度的准确性、均匀性、以及升降温速度。

  1. 温度的准确性:是指样品孔温度与设定温度的一致性,它直接关系到实验的成败。因而对PCR扩增仪而言温度控制就意味着产品质量。

  2. 温度的均匀性:是指样品孔间的温度差异,它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。

  3. 升降温速度:更快的升降温速度,可以有效缩短反应时间和可能的非特异性结合、反应的时间,从而提高PCR反应特异性。

  相较于传统的相对稳定耐用的机械式,新的半导体温控技术——TEC温度控制技术具有升降温更快速的优势,已经成为PCR扩增仪的首选温度控制技术。

  半导体制冷器(ThermoElectricCooler,简称TEC)是利用半导体材料的帕尔贴效应制成的。如图下所示,帕尔帖效应是指当直流电流通过两种半导体材料组成的电偶时,其一端吸热,一端放热的现象。TEC包括一些P型和N型对(组),它们通过电极连在一起,并且夹在两个陶瓷电极之间,当有电流从TEC流过时,电流产生的热量会从TEC的一侧传到另一侧,在TEC上产生″热″侧和″冷″侧,这就是TEC的加热与致冷原理。 

核糖核酸扩增荧光定量

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  帕尔帖效应,PN节以及热流动示意图

  PCR扩增仪一般具有两种温控模式,即模块温控模式(Block-control)和反应管温控模式(tube-control)。管内样品的温度无法与温控模块同时达到预设温度,特别是PCR反应中的孵育过程一般为30秒或更短,如果采用只有模块温控模式的话,反应混合物孵育的时间与程序设定的时间会有相当大的差距。为了达到反应管内部温度精确控制,需采用反应管控制模模式,通过温度控制算法进行参数标定和补偿,确保反应混合物按照程序设定的时间维持预设温度。

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